胞質(zhì)注射實(shí)驗(yàn)

一、胞質(zhì)注射實(shí)驗(yàn)技術(shù)定義與核心原理

胞質(zhì)注射是顯微注射技術(shù)的一種，通過顯微操作系統(tǒng)將外源基因直接注入細(xì)胞質(zhì)（而非細(xì)胞核），實(shí)現(xiàn)基因?qū)搿Ｆ浜诵臋C(jī)制包括：

1. 非整合性表達(dá)：外源DNA以游離體形式存在，通過細(xì)胞自身轉(zhuǎn)錄機(jī)制表達(dá)，不整合至宿主基因組（區(qū)別于原核注射的隨機(jī)整合）。

2. 適用性廣：可操作單細(xì)胞（如原代細(xì)胞、干細(xì)胞）及多細(xì)胞胚胎（如2細(xì)胞期胚胎）。

3. 瞬時(shí)表達(dá)為主：外源基因隨細(xì)胞分裂逐漸丟失，表達(dá)周期較短（通常<72小時(shí)）。

生物學(xué)基礎(chǔ)：
依賴細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶完成外源基因表達(dá)，無需核定位信號(hào)（NLS）介導(dǎo)。

二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

（一）設(shè)備與材料準(zhǔn)備

（二）操作步驟

• 關(guān)鍵參數(shù)：

• 注射壓力：5-10 hPa（過高導(dǎo)致細(xì)胞破裂）。

• 注射時(shí)長(zhǎng)：?jiǎn)渭?xì)胞≤30秒，避免細(xì)胞脫水。

• 存活率控制：熟練操作下細(xì)胞存活率>80%，胚胎存活率>70%。

（三）表達(dá)驗(yàn)證方法

1. 熒光標(biāo)記法：

• 注射含GFP/RFP報(bào)告基因的載體，24小時(shí)后熒光顯微鏡觀察。

2. 蛋白檢測(cè)法：

• Western Blot或免疫組化檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)。

胞質(zhì)注射實(shí)驗(yàn)